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一、熒光基礎知識

在顯微成像中，熒光指的是一種光致發光現象，某些分子能吸收特定波長的光線，然后再發射出其他波長的光線的物理現象，這種分子一般稱為熒光團。通常情況下，由于斯托克斯位移，熒光團的激發峰值和發射光譜之間存在差值，發射光線能量低于吸收光線，波長比激發光更長。

熒光現象有兩種：自發熒光與繼發熒光。自發熒光也稱固有熒光，是指經照射后就能發出熒光；繼發熒光也稱二次熒光，物質經照射后不能或只能部分發生微弱熒光，需先用熒光染料標記處理，再經照射才能發生熒光。目前在熒光顯微技術中，主要利用的是繼發熒光現象。

念珠藻葉綠體的自發熒光，明美MF52-N拍攝

熒光產生包含激發和發射兩個過程，在熒光顯微技術中具體體現為以下幾個關鍵部件：

（1）激發光源：主要包含以下兩個指標

? 光源光譜覆蓋發射光譜：熒光團在特定波段范圍才能被大部分激發，因此激發光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光團激發特征。

? 發射光譜波段的強度：熒光信號一般較弱，需要使用較高亮度的激發光以產生較強信號的發射熒光信號。

（明美-四通道LED光源MG120，寬光譜 + 高光功）

（2）激發塊：用于形成特異性激發/發射的一組濾光片，一般包含以下三個

? 激發濾光片EX：濾過光源中特定波段的光，用以激發樣本中特定染料

? 發射濾光片EM：允許熒光團發射的特定波段的光通過

? 二向分色鏡DM：反射激發波段的光，透過發射波段的光。透射熒光顯微鏡沒有這個濾光片，但目前主流都是落射熒光顯微鏡，會有二向分光鏡。

（明美可定制適配四家公司，不同波段需求的激發塊）

二、熒光顯微成像的應用

熒光顯微鏡利用自發熒光或繼發熒光現象，廣泛用于生物（醫學）、礦物、材料科學等領域的顯微熒光觀測。①在生物學領域，主要借助熒光染料標記，可準確和詳細地識別細胞和亞微觀細胞成分。②在礦物學領域，通常用于研究有自發熒光特性的物質，如石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。③在材料科學，可用于紡織工業或造紙業來分析基于纖維的材料，包括紡織品和紙張，在半導體領域，也可用來觀測具有熒光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED熒光顯微鏡觀察SBS改性瀝青

（MF43-N拍攝的磁珠熒光圖片）

熒光顯微技術在生物學領域中應用是廣泛也是復雜的，主要是對細菌、細胞、組織或小型生物（如斑馬魚等模式生物）進行標記成像，它的微觀層面都是通過熒光染料對分子層面進行標記。從熒光染料的選擇看，通常需要考慮幾個因素，一是熒光染料標記的位置，二是該染料對應的激發特征，包括吸收光譜特征和發射光譜特征。借助熒光染料，熒光顯微技術不只局限于蛋白質，它還可以對核酸、聚糖進行染色，甚至鈣離子等非生物物質也可以檢測。以下根據染料結合的位置列舉了一些常見的熒光染料及應用范圍：

FITC熒光染色，MF52-N拍攝

（1）免疫熒光（IF）：主要標記的是蛋白質。免疫熒光技術利用抗體可以和相應抗原特異性結合的特性，主要有兩種方式：一是利用內源熒光信號，即通過克隆技術用遺傳學方法將熒光蛋白與目的蛋白相連，如GFP等；二是利用熒光標記的抗體與目的蛋白特異性結合。

? FITC（異硫氰酸熒光素）：是一種有機熒光染料，495/517 nm為該染料激發/發射峰值，可以和蛋白質上的基團結合，主要用于免疫熒光和流式細胞術中。

? TRITC（四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸）：屬于羅丹明家族的衍生物，550/573 nm為該染料激發/發射峰值，可與蛋白質結合。

? 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特異性吸附少，消光系數高，熒光量子產率高，從而讓標記顯影時背景弱，信號強。除細胞顯影外，它們也常用于生物篩選、蛋白免疫印跡、生物醫學顯影、小動物體內成像等。

? Alexa Fluor系列：屬于帶負電荷且親水的熒光染料系列，是不同基礎熒光物質的磺化形式。這些產品標識涵蓋了對應的激發波長，相比于FITC等染料，具有更好的穩定性和熒光亮度。

DAPI熒光染色，MF52-N拍攝

（2）DNA染色：主要標記核酸。同蛋白質一樣，對核酸進行標記與研究同樣有重要意義，如對細胞核（主要成分為核酸）進行染色標記可以判斷細胞的數量和位置。

? DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：當DAPI與雙股DNA結合時，在358nm處有一個吸收峰值，在461nm處有一個發射峰值，其發射光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可與RNA結合，但產生的熒光強度不及與DNA結合的結果。DAPI可以透過完整的細胞膜，因此被廣泛用于活細胞和固定細胞的染色。

? Hoechst（33258、33342、34580）：這三種染料都可在350nm左右的紫外光激發，在461nm處發出藍靛色熒光。與DAPI類似，Hoechst可透過完整細胞膜，被廣泛用于活細胞和固定細胞染色。

? PI（碘化丙啶）：是一種不能透過細胞膜的DNA染色劑。與核酸結合后，激發波長為538 nm，發射波長為617 nm。由于該染色劑無法進入完整的細胞中，因此該染色劑常用于區分細胞群中的活細胞和死細胞。

Fura2鈣離子探針做的研究圖片， 引自公開文獻
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）離子成像：研究細胞中各種離子的流動與分布對細胞活動的深入理解有重要作用。通過各種離子指示劑，如鈣離子、鈉離子、鎂離子、鋅離子等指示劑與離子結合形成熒光團，利用光譜特征檢測對應離子的分布狀態。

三、熒光顯微成像的挑戰

應用熒光顯微技術進行成像的過程中，不僅要考慮成像的質量，包括分辨率、對比度、熒光信號強弱、背景光、多通道成像等，還要考慮熒光染料、光照等對樣本的影響，比如熒光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了熒光顯微技術應用中的常見挑戰與應對方法：

汞燈需搭配帶計時器的復雜控制箱來使用

（1）激發光源選擇和使用。傳統熒光成像使用的是高壓汞燈，具有特異性的光譜特征和較高的光強，但使用有很多麻煩，首先需要預熱，然后光強靠ND濾鏡調節，壽命較短可能就200小時，在壽命用完前還會有光強衰減問題，需要調整ND濾鏡，替換燈泡后需要重新校中。目前很多應用都用LED熒光光源取代汞燈作為熒光光源，如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100，壽命長單個可以頂50個汞燈，光強更穩定可控，并且可以即開即用，省事省心。

明美可定制適配四家企業的濾光片組

（2）濾光片質量和匹配度。激發塊中的濾光片質量會影響激發光和發射光的透過率，影響熒光效率并帶來雜散光和背景噪聲問題。同時，濾光片的參數能否匹配染料的激發峰和發射峰，也會對熒光效果產生重大影響。對于簡易熒光需求，明美建議使用數顯熒光模塊，整合光源和BGU等常用激發塊，可以為四家企業顯微鏡升級熒光觀察，簡單易用效果好。對于專業熒光需求，明美提供匹配四家企業主流熒光顯微鏡的激發盒和濾光片組，可按需定制不同濾光片組合，如鈣離子Fura2探針需要用U激發G發射，一般的U激發B發射濾光片組并不適合。

（MF43-N+MC50-S拍攝的小鼠腦片熒光圖像）

（3）光毒性與熒光染料毒性：在生物學領域的熒光成像中，需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響，如細胞內的有機分子在與氧反應時吸收光發生分解并產生自由基，部分熒光染料本身也能產生自由基，這是引起細胞等生物樣本損傷的主要來源。通常的應對思路是：①使用具有較低能量（波長較長）激發光譜的熒光染料；②盡可能低的光強和盡可能短的激發時間，需要在成像質量與樣本健康之間保持平衡；③降低幀速率，尤其在長時間的熒光成像中，這種情況需要提高相機的靈敏度，保證捕獲微弱的熒光信號。

（單通道熒光拍攝，經軟件合成多色熒光圖像）

（4）多色熒光成像：在生物學領域應用較多，尤其是在對活細胞標記成像時，需同時對多種物質進行標記，并在一個圖像中顯示，而大多數熒光染料具有寬發射光譜，在使用多種染料標記時會出現熒光光譜重疊現象。對于多色熒光成像，有兩種應對思路，一是針對每種染料使用對應的單通道窄帶濾光片，后通過軟件進行合成，這種方式對成像速度及軟件圖像處理提出較高要求；二是使用寬光譜光源同時激發，選用雙通濾光片或多通濾光片，這種濾光片的的特點是允許兩種或以上波段熒光信號通過，可實現一組濾光片同時觀察兩種或以上熒光染料，這種方式要求相鄰的發射光譜范圍沒有重疊，所得到的熒光信號之間能較好的被區分。

（雙通濾光片熒光拍攝，鏡下可同時觀察到B\G兩種熒光信號）

來源：https://www.mshot.com/article/1527.html